Для гликопротеинов аналитическая задача будет включать не только характеристику состояния полипептидной цепи, но и определение структуры связанных углеводных групп. В зависимости от типа связи (N- или O- гликозилирование) можно использовать подходы через анализ гликопептидов и / или через анализ отщепленных гликанов.

Такая задача является довольно распространенной, уже просто потому, что наиболее массовые объекты биофармацевтики – моноклональные антитела – содержат в цепи как минимум один сайт N-гликозилирования. Консервативный сайт расположен в Fc-регионе тяжелой цепи IgG на характерном участке последовательности EEQYNSTYR (или его вариантах, например, EEQYNSTFR). На рисунках 1-3 показаны примеры анализов отщепленных гликанов различных антител, выполненных в нашем центре.  В общем случае набор основных гликанов этого сайта близок – он включает главным образом структуры FA2, FA2G1, FA2G2, однако внутри этого набора могут наблюдаться количественные различия в соотношении между пиками, – в зависимости от типа препарата или даже от его серии. Также индивидуальный препарат характеризуется сопутствующим набором минорных гликанов (Рис. 3).

Технически анализ отщепленных N-гликанов является многостадийной процедурой, которая включает (1) первичную пробоподготовку, (2) ферментативное дегликозилирование , (3) введение флуоресцентной метки, (4) предочистку с использованием твердофазной экстракции, и, наконец, (5) хроматографическое разделение производных гликанов. При анализе сахаров удобно использовать «гидрофильную» хроматографию (HILIC, hydrophilic interaction chromatography). Детекция ведется с использованием одновременно как флуоресцентного, так и масс-спектрометрического детекторов, причем данные первого используются в основном для построения количественного распределения. Идентификация проводится по данным масс-спектрометрии, по значениям точных масс и по спектрам фрагментации; в частности, такой подход позволяет выявить возможное наличие нежелательных компонентов, например, содержащих гликолил-нейраминовую кислоту (Рис. 4) или a-Gal-Gal-форм (Рис. 5).

Тип выбранной метки важен для успешного анализа; обычно мы используем прокаинамид или RapiFluor MS; чувствительности распространенных меток 2-AB или 2-AA оказывается недостаточно для идентификации минорных гликанов.

В то время как моноклональные антитела с единственным сайтом гликозилирования Fc-региона характеризуются относительно простым набором структур, характеристика белков, молекула которых включает несколько сайтов, представляет собой более сложную аналитическую задачу. Хорошим примером является «Эрбитукс» (цетуксимаб): в нем содержится два сайта гликозилирования, причем каждый  имеет свой уникальный набор гликанов (Рис. 6). Для определения состояния индивидуального сайта удобным подходом будет анализ пептидов, образующихся после ферментативного гидролиза белка. При разделении полученных гликопептидов с использованием обращенно-фазовой хроматографии степень сродства к сорбенту определяется в первую очередь свойствами пептидного участка и в меньшей степени – углеводного, поэтому для каждого сайта гликозилирования гликопептиды элюируются в своей области (Рис. 7).

Состояние индивидуальных сайтов можно определить и через процедуру отщепленных гликанов, однако в этом случае стартовым материалом должен быть не исходный белок, а его части, включающие не более одного сайта гликозилирования. Получение таких фрагментов возможно различными (ферментативными) способами; в конечном счете проводится их препаративное разделение. Для выделенных фракций проводится дегликозилирование и дериватизация с сопутствующими процедурами. Пример результата анализа отщепленных гликанов цетуксимаба показан на рисунке 8.

 

 

Набор N-гликанов некоторых белков может включать весьма сложные разветвленные структуры. В качестве примера можно привести эритропоэтин (ЭПО, EPO) и его искусственный аналог – дарбэпоэтин (ДПО, DPO) – ОФС.1.7.1.0016.18. Связанные олигосахариды здесь в первую очередь представлены тетраантенными структурами с высоким содержанием сиаловых кислот, часто достроенными  вставками лактозамина; остатки сиаловых кислот как правило дополнительно ацетилированы. В результате набор форм, в том числе изомерных, будет включать сотни возможных компонентов, из которых несколько десятков оказываются преобладающими (Рис. 9,10). Характеристика подобных объектов предполагает описание структуры основных гликанов и также описание общих параметров, – таких как: степень разветвленности, степень сиалирования, степень ацетилирования, распределение по числу лактозаминовых вставок. В случае эритропоэтина / дарбэпоэтина такая характеристика существенна, так как между препаратом-оригинатором и биоаналогами часто наблюдаются существенные различия в количественных параметрах гликанового профиля (Рис. 11).

 

Молекула эритропоэтинов содержат не только сайты N-гликозилирования, но и сайт O-гликозилирования (Рис. 12). Белки, содержащие O-гликозилированные участки, не столь распространены; тем не менее эта группа включает и другие важные лекарственные препараты, например этанерцепт. Анализ O-гликанов проводится в основном через гликопептиды, так как в этом случае не существует надежного метода получения отщепленных углеводных фрагментов (Рис. 13).

 

 

Существует несколько систем обозначения N-гликанов; часто используется  Оксфордская схема, по которой названия формируется следующим образом:

Вставка, содержащая три остатка маннозы и два N-ацетилглюкозамина (trimannosyl core), обычно явно не указывается, поскольку она является общей для всех N-гликанов.

Наиболее часто встречающиеся в антителах N-гликаны указаны в таблице (кликните, чтобы увидеть таблицу):

 

Схематичное изображение гликана	Обозначение гликана
	M3
	FM3
	M4
	A1
	M5
	FA1
	A2
	FA1G1
	FA2
	FA2G1
	FA3
	FA2B
	FA2G2
	FA3G1
	FA2G1S1
	FA2G2S1
	FA2G2S2